Introduzione
Per studiare l'effetto di un agente antineoplastico i modelli attualmente utilizzati sono di due tipi: colture cellulari tumorali e modelli animali. Ambedue questi modelli sperimentali pur essendo significativi e compatibili con il processo tumorale che si svolge nell’individuo, presentano alcune limitazioni. La possibilità di ricreare sperimentalmente le condizioni che si attuano nell’individuo colpito da tumore possono essere ricreate per mezzo dell’organo coltura. In queste condizioni viene mantenuto l'ambiente nel quale il tumore si sviluppa. Tale possibilità si attua coltivando il tumore utilizzando una matrice di gel di collagene. Il vantaggio di utilizzare colture del tumore solido è che il microambiente tumorale rimane intatto durante l'esperimento . Così , tutti i fattori che possono influire sulla funzionalità, quali le interazioni cellula-cellula , interazioni cellula-matrice e fluido interstiziale all'interno di questo ambiente tridimensionale , vengono conservati (Varani, J., M.K. Dame, K. Wojno, L. Schuger, and K.J. Johnson. 1999. Characteristics of nonmalignant and malignant human prostate in organ culture. Lab. Invest. 79:723–731 ) . In conclusione lo studio proposto darebbe indicazioni utili grazie alla coltura di biopsie tumorali al fine di mantenere ed evidenziare le caratteristiche istologiche / istochimiche che contraddistinguono il tessuto non maligno da quello maligno e l’effetto di un trattamento antineoplastico.

1. Metodica sperimentale
1.1 Organi bersaglio: Da topi del ceppo C57BL/6 inoculati con cellule B16-F10, secondo una metodica pubblicata (Di Giacomo G, Lentini A, Beninati S, Piacentini M, Rodolfo C. In vivo evaluation of type 2 transglutaminase contribution to the metastasis formation in melanoma. Amino Acids. 2009,36(4):717-24) e mantenuti in alimentazione controllata, sono stati rimossi gli organi bersaglio (polmone e fegato). Le autopsie sull’animale effettuate dopo circa 60 giorni dall’inoculo hanno evidenziato la presenza di un numero elevato di metastasi in particolare nel polmone, L’organo è risultato completamente ricoperto di metastasi ricche di melanina (Figura 1). Il fegato ha presentato evidenti segni di degradazione da ipossia.


FIGURA 1

1.2. Inoculo intramuscolo: La linea cellulare murina melanoma B16-F10 è comunemente utilizzato per valutare in vivo la formazione di tumori e metastasi in topi C57BL / 6 . Questa linea cellulare singenica è stata utilizzata per ottenere tumori primari solidi quando iniettata sottocute negli animali. Per valutare la formazione di tumori primari , C57BL / 6 topi sono stati inoculati nella zampa posteriore destra con cellule di melanoma murino B16-F10. Il tumore solido si è sviluppato rapidamente in 15 giorni (Figura 2.A) per poi espandersi (Figura 2.B) e raggiungere in 60 giorni un volume 5 volte maggiore di quello iniziale.

3. Metodica di indagine

3.1 Organo colture
Dagli espianti delle masse tumorali sono state effettuate sezioni di 100-120 - mm3 . Dopo la rimozione dei tessuti necrotici , campioni degli organi bersaglio (1.) o di massa tumorale (2.), sono stati sezionati in pezzi di 2-3 - mm3 e posti su spugne di collagene “presoaked” ( Johnson & Johnson ) RPMI 1640 completo (RPMI 1640 con 10 % FCS , 1 % di L- glutammina , 1 % di penicillina / streptomicina , 1 % di amminoacidi non essenziali , e 1 % piruvato di sodio). Le colture sono state trsaferite in piastre da sei pozzetti e 3 ml di mezzo sono stati aggiunti a ciascun pozzetto per raggiungere la parte superiore del gel immergendo i campioni. Le colture sono state incubate a 37 ° C , in atmosfera umidificata al 95 % di aria e 5 % CO2 . I campioni sono stati trattati con , fitoemoagglutinina ( 1 mg / ml ; Sigma - Aldrich ) o forbolo miristato acetato ( 50 ng / ml ; Sigma - Aldrich ) più ionomicina ( 0,5 mg / ml ; Sigma - Aldrich) , con o senza IL- 2 ( 100 UI / ml ; Chiron Corp. ). N - idrossi - L - arginina ( 0,5 mM ; Cayman Chemical) e L - NMMA ( 0,5 mM ; Cayman Chemical).


3.2 Indagine istologica
I campioni di organo tumorale di controllo e trattati sono stati fissati in liquido di Bouin per gli studi microscopici. Le microsezioni di paraffina sono state colorate con ematossilina e eosina, per esaminare l’estensione dell’angiogenesi, l’invasione, la migrazione e la proliferazione delle cellule tumorali.

3.2 Trattamento degli organi
Gli organi (polmone, fegato e tumore da inoculo intramuscolo) sono stati coltivati in presenza di Citozym* diluito nelle piastre di coltura 1:2 e 1:4 e i valori ottenuti confrontati con il controllo (polmone, fegato e tumore da inoculo intramuscolo trattati con Tampone fosfato salino - PBS).
*sterilizzato per filtrazione a 0.2 μm.

4. Risultati
4.1 Organo coltura del fegato invaso da metastasi
La coltura del fegato di topo, invaso da metastasi è ottenuto da inoculo splenico di cellule di melanoma murino del ceppo B16-F10, non ha permesso di poter valutare l’azione del Citozym in coltura d’organo. I problemi incontrati si presume derivino dal fatto che l’organo in coltura conserva le proprie capacità detossificanti, metabolizzando molto rapidamente i componenti dell’integratore. L’analisi biochimica del mezzo di coltura durante l’incubazione, ha evidenziato la sintesi di urea, ammoniaca, aldeidi e chetoni (Figura 3). Si presume che questi cataboliti possano ovviamente agire da agenti citotossici. Si richiede una ulteriore indagine per poter discriminare l’effetto tossico da quello antiproliferativo. Inoltre è molto importante poter escludere che tale potenziale effetto tossico non sia presente anche nelle colture di polmone e di massa tumorale da inoculo intramuscolare.

FIGURA 3


4.2 Organo coltura del polmone invaso da metastasi
Il trattamento del polmone con metastasi, ottenuto con inoculo nella vena caudale dell’animale di cellule di melanoma murino della linea B16-F10, ha permesso di porre in coltura un organo invaso


da un numero elevato di metastasi trattato per 60 giorni con una soluzione di Citozym 1:4 (una parte di Citozym disciolto in 3 parti di mezzo di coltura).. La concentrazione 1:2 (una parte di Citozym disciolto in una parte di mezzo di coltura) è stata scartata a causa di problemi con l’ossigenazione dell’organo stesso. L’ipossia del tessuto trattato potrebbe derivare dall’elevata viscosità del mezzo di coltura. Risulta evidente la regressione del numero di metastasi nel polmone trattato, rispetto all’organo non trattato (Figura 4). E’ necessario considerare che il polmone viene prelevato dall’animale dopo 21 giorni dall’inoculo nella vena caudale, in maniera da permettere la completa invasione. Questo viene posto in coltura utilizzando un mezzo nutritivo, ossigenando il tessuto in presenza di Citozym.

FIGURA 4

4.3 Organo coltura del tumore ottenuto dall’inoculo intramuscolare
Il trattamento della massa tumorale da inoculo intramuscolare sul topo C57BL / 6 con il Citozym alle due concentrazioni usate, ha evidenziato una riduzione drastica del volume del tumore rispetto al controllo non trattato (Figura 5). Si sottolinea il fatto che non è stato trattato l’animale per via orale ma direttamente la massa tumorale in coltura con l’integratore presente nel mezzo di coltura alla concentrazione di 1:4. Anche in questo caso la concentrazione 1:2 è stata scartata a causa di problemi con l’ossigenazione dell’organo stesso. L’ipossia del tessuto trattato potrebbe derivare dall’elevata viscosità del mezzo di coltura.


 FIGURA 5
Dalla Figura 5 si evince che la proliferazione cellulare della massa tumorale, quando confrontata con il controllo non trattato e mantenuto in PBS, è fortemente rallentata dal trattamento, mantenendosi il volume dell’organo molto simile anche dopo 60 giorni di coltura. Il vantaggio della coltura d’organo deriva dal fatto che i principi attivi del Citozym possono facilmente raggiungere le cellule che compongono la massa tumorale, senza subire la degradazione nel sistema gastroenterico. E’ proprio questa degradazione, che fino ad oggi non ha permesso di evidenziare la potenziale azione antineoplastica del Citozym. I dati ottenuti dall’indagine istologica hanno permesso di evidenziare anche una potente azione antiangiogenica. I dati sono stati ottenuti valutando diversi parametri, come il volume, il peso (Figura 6), l’angiogenesi e il grado di necrosi del tessuto. Tutti questi parametri sono risultati ridotti sensibilmente


5. Conclusioni
Dai risultati ottenuti si possono evincere due conclusioni interessanti. Il Citozym possiede potenziali caratteristiche antiproliferative, come dimostrato dal mancato sviluppo della massa tumorale in coltura (paragrafo 4.3) rispetto al controllo. Infatti nel tumore ottenuto inoculando cellule della linea B16-F10 nel muscolo della zampa posteriore di un topo singenico, il Citozym riesce a ridurre drasticamente il volume e il peso della massa tumorale (vedi Figura 5 e 6), influenzando anche l’angiogenesi, proprietà che potrebbe spiegare l’attività antiproliferativa (dati non mostrati). Il modello dell’invasione del polmone (paragrafo 4.2), ha permesso invece di evidenziare una riduzione del numero di metastasi durante la coltura d’organo in presenza di Citozym nel mezzo di coltura (Figura 4). Questo dato evidenzia una potenziale capacità di riduzione delle metastasi, che potrebbe, con l’estensione delle ricerche, suggerire l’uso di questo integratore come ausilio ai farmaci antimetastatici. Purtroppo il modello epatico (paragrafo 4.1) non ha dato i risultati previsti, a causa della probabile formazione di agenti tossici, identificati come urea, ammoniaca, aldeidi e chetoni (Figura 3). Il suggerimento che scaturisce è quello di poter migliorare il modello, riducendo il catabolismo epatico e proteggendo l’epatocita da eventuali agenti ossidanti. A tal fine e per poter rendere pubblici i risultati, con una pubblicazione scientifica da sottoporre alla comunità scientifica, si propone l’estensione della ricerca sul fegato, ma anche su gli altri due organi in coltura, per poter escludere la possibilità che i dati ottenuti siano realmente dovuti all’azione del Citozym e non a tossine prodotte durante la coltura. Quest’ultima osservazione potrebbe rendere difficile la pubblicazione in quanto i revisori della pubblicazione potrebbero sollevare critiche al protocollo sperimentale adottato. Si allega a tal fine una proposta di preventivo di spesa supplementare che potrebbe risolvere il problema e produrre una relazione scientifica valida e quindi pubblicabile. Deve essere sottolineata l’utilità del modello organo coltura, poiché riduce drasticamente tutte quelle variabili presenti nell’organismo nella sua interezza. Tali variabili possono influenzare negativamente i risultati. E’ sufficiente considerare come esempio, l’attraversamento dell’ambiente gastrico da parte dei componenti del Citozym. Tale ambiente potrebbe catabolizzare alcuni dei principi attivi dell’integratore riducendone l’efficacia. Non ultimo, anche l’inoculo del prodotto per via ematica o intraperitoneale, potrebbe far scaturire l’azione protettiva del sistema immunitario, con conseguenti mutamenti nella composizione del prodotto. L’organo coltura evita questi problemi evidenziando la reale azione dell’agente in studio.


5.Proposta di completamento dello studio
In riferimento ai risultati sopradescritti si propone alla Spett. Citozeatec srl di proseguire la sperimentazione per verificare che i principi attivi del Citozym, restino integri durante i trattamenti.
A tal fine si propone un approfondimento della sperimentazione per il completamento dello studio dell’organo epatico . Inoltre è necessario il controllo del destino dei componenti dell’integratore.
Infine deve essere ripetuta la coltura epatica, per ridurre la probabile ipossia e evitare l’azione detossificante dell’organo.

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CITOZEATEC è una Azienda nata nel 2006 che utilizza le più avanzate Biotecnologie Industriali a Conversioni Enzimatiche sequenziali per produrre i propri Integratori Alimentari che vengono definiti Biodinamici grazie alla loro capacità di favorire i metabolismi bio-energetici intracellulari (Ciclo di Krebs, Glicolisi, Gluconeogenesi, Ciclo dell'Urea, ecc.) che sono fondamentali per tutti gli altri metabolismi della cellula.